一种优化的IFN-γELISpot测定法，用于灵敏和标准化监测细胞介导免疫的CMV蛋白反应性效应细胞

在健康个体中，巨细胞病毒(CMV)感染受到CMV特异性细胞介导免疫(CMI)的有效控制。然而，免疫功能低下的个体中CMI的功能障碍会导致不受控制的CMV复制和严重的临床并发症。因此，对CMV特异性CMI的密切监测具有临床相关性，并可能使CMV疾病的预后可靠，并有助于个性化治疗决策。

这项工作的目的是优化和技术验证IFN-γELISpot测定法，用于对CMV反应性效应细胞进行标准化、灵敏和可靠的量化。使用Bioreader®5000Eα(BIO-SYS)对IFN-γ特异性斑点形成细胞(SFC)进行计数。

除针对新冠病毒的Ad5重组蛋白疫苗外，其他病毒的重组蛋白疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗等在进入临床或者临床前期的动物实验的研究中，都是选择的IFN-γELISpot方法评估疫苗引起的细胞免疫效应。为什么是ELISpot这种方法，不是ELISA?为什么是IFN-γ这个指标，不是其他的细胞因子？

为什么是ELISpot？

在免疫学领域中，相关疾病和疫苗的研究等均是基于体液的免疫应答（HumoralMediatedImmuneResponse，HMI）和细胞介导的免疫应答（CellMediatedImmuneResponse，CMI）为基础。在以往的免疫应答研究机制中常使用酶联免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）来检测体液中游离的细胞因子或抗体，但由于游离的循环抗体或细胞因子的半衰期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，因此ELISA并不能真实反映体内抗体及细胞因子的实际水平。

自1983年，Sedgwick和Czerkinsky结合了细胞培养技术和ELISA技术，建立了体外检测特异性分泌抗体细胞（Antibody-SecretingCells，ASCs）和分泌细胞因子（Cytokine，CK）细胞的固相酶联免疫斑点技术（Enzyme-LinkedImmunospotAssay，ELISpot），可从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该法及高灵敏度，特异性强，高通量，单细胞水平，功能性检测以及低成本等诸多优点于一身，是研究Th1/Th2的反应，疫苗研制，病毒感染的检测和治疗，肿瘤学，传染性疾病，自身免疫性疾病和器官移植的理想工具。

为什么是IFN-γ？

IFN-γ作为免疫活性细胞分泌的细胞因子在诱导抗病毒免疫中起着重要的免疫调理作用，包括激活细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxiclymphocyte,CTL）、自然杀伤细胞（naturalkillercell，NK）细胞和吞噬细胞等，而在疫苗免疫后机体产生IFN-γ的水平实际上反映辅助性T细胞的活动。因此，检测IFN-γ的水平就是间接地检测辅助性T细胞活性。目前，检测IFN-γ的水平已经逐渐代替各种传统的细胞免疫检测手段，成为检测细胞免疫效果的一种重要方法。

因此，建立IFN-γELISpot检测方法，可以作为检测和评价疫苗细胞免疫的有效方法，目前也已成为疫苗引起的细胞免疫效应评估的“金标准”。

关于Bioreader

由德国BIO-SYS有限公司研制，拥有专利的双远心照明系统，通过使用“光度”强度照明和梯度来区分真/假点。

实验结果输出：

总而言之，这种优化、标准化和用户友好的 CMV 特异性 IFN-γ ELISpot 测定满足用于监测 CMV 特异性 CMI 功能的敏感和可靠诊断测试的所有条件。除了在健康个体中进行验证（本研究）外，它还适用于在代表移植前患者的血液透析患者队列中评估 CMV 特异性细胞介导的免疫[ 49 ]。有必要在免疫功能低下的患者（例如移植受者）中进一步验证该测定法，以确定其是否适合帮助临床医生评估 CMV 再激活和疾病的风险，并可能对患者进行个体化治疗管理。

参考文献

Barabas, S., Spindler, T., Kiener, R. et al. An optimized IFN-γ ELISpot assay for the sensitive and standardized monitoring of CMV protein-reactive effector cells of cell-mediated immunity. BMC Immunol 18, 14 (2017). https://doi.org/10.1186/s12865-017-0195-y