Cell mediated cytotoxicity（CMC）— 细胞介导的细胞毒性

摘要 

引文自: [1]] 

“免疫系统能够消除恶性细胞这一认识刺激了各种免疫治疗方法的发展。

在过去的几十年里，这已导致许多癌症的临床治疗被证实。最近引入的检查点抑制剂尤其成功和具有革命性，它有效地恢复了沉默的 T 细胞的功能。

在一些患者中，它们诱导了完全和持久的反应，希望永久治愈。然而，检查点抑制剂仅在一小部分患者中显示活性，并且由于其潜在机制，它们增加了自身免疫的风险。

因此，仍然需要具有更广泛活性和高肿瘤特异性的有效治疗方法。”

用嵌合抗原受体 (CAR-T 细胞) 进行基因工程改造的 T 细胞已显示出对血液系统恶性肿瘤的疗效。六种 CAR-T 疗法被批准用于各种 CD19+ B 细胞恶性肿瘤或 BCMA+ 骨髓瘤。作用机制是溶解所有 CD19+ 或 BCMA+ 细胞。这种细胞介导的细胞毒性 (CMC) 可以由具有不同效应机制的 T 细胞、NK 细胞、NKT 细胞和巨噬细胞执行。

到目前为止，还没有 CAR-T 细胞被批准用于治疗实体癌。

普遍缺乏肿瘤特异性靶抗原和恶劣的肿瘤微环境是讨论中最重要的障碍。

用肿瘤特异性 T 细胞受体 (TCR-T 细胞) 改造的 T 细胞是很有前途的替代方案。第一种 TCR-T 细胞疗法最近已获批准 (https://

www.adaptimmune.com/investors-and-media/news-center/press-releases/detail/271/adaptimmune-receives-u-s-fda-accelerated-approval-of)：Afamitresgene autoleucel (afami-cel，以 Tecelra 为商品名销售) 针对表达癌症抗原 MAGE-A4 和 HLA-A*02:01 的软组织肉瘤。

在 Tecelra 等细胞疗法获准用于生产和治疗患者之前，TCR-T 细胞必须证明靶标特异性，还必须证明靶标有效性。靶向特异性可通过 ELISpot 试验分析 TCR-T 细胞与抗原阳性和 HLA 匹配的肿瘤细胞共孵育后的反应，或通过流式细胞术测量 CD137 

(4-1BB)、CD107a、CD69 等 T 细胞活化标记物的上调来测量。然而，靶向有效性只能通过 T 细胞介导的细胞毒性 (T-CMC) 来确定，T 细胞介导的细胞毒性显示 T 细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。杀伤是由 T 细胞效应功能引起的，例如从细胞毒性颗粒中释放穿孔素和颗粒酶。在肿瘤细胞方面，可以通过肿瘤细胞的活/死染色或受攻击的肿瘤细胞内凋亡途径的激活来测量效果。

在本应用说明中，我们分析了 TCR-T 细胞识别由突变 KRAS 处理并由 HLA-A*01:01 呈递的新抗原的 T-CMC。靶细胞是携带 KRAS 突变的 NCI-H460 NSCLC 细胞。由于这些细胞对 HLA-A*01:01 呈阴性，因此这些细胞被稳定地转导为产生 HLA 等位基因的 NCI-H460/HLA-A*01:01 细胞。只有 NCI-H460/HLA-A*01:01 才能被 TCR-T 细胞识别。NCI-H460 作为阴性对照。  

简介 

模块化/可升级的 Eazyreader® 7000 可用于自动化和记录细胞介导的细胞毒性检测

应用 #1：384/96 孔透明底板中的球体

应用 # 2 黑色侧壁 96 孔微量滴定板中的单细胞和细胞簇

a.方法NCI-H460 和 NCI-H460/HLA-A*01:01 在 96 孔板中生长，并形成 2D/3D 培养物（单层细胞和小球体）。TCR-T 细胞采用睡美人 (SB) 转座子技术生产。简而言之，健康供体的 T 细胞通过 4D 核转染 (Lonza) 处理，转染试剂混合物包括 (1) 靶向 T 细胞内源性 TCR 基因以将其敲除的 CRISPR/CAS9 RNP、(2) 体外转录的编码 SB 转座酶的 RNA 和 (3) 编码 αβTCR 构建体的转座子纳米质粒，该构建体特异性针对 HLA-A*01:01 呈递的突变 KRAS 肽。处理后，TCR-T 细胞在培养中扩增，10-12 天后通过 FACS 筛选出内源性 TCR 阴性和重组 TCR 阳性 TCR-T 细胞。分离的细胞进一步扩增数周，然后分批冷冻。为了进行功能分析，将细胞解冻，在培养基中静置过夜，然后应用于杀伤试验。在接种 NCI-H460 和 NCI-H460/HLA-A*01:01 细胞两到三天后，将它们与 TCR-T 细胞以不同的效应器与靶标比率孵育过夜。

b.样品制备…测试反应为：

1.TCR-T cells only ... ...

2.TCR-T cells + TransACT (Miltenyi) ... ...

3.TCR-T cells + NCI-H460 ... ...

4.TCR-T cells + NCI-H460/HLA-A*01:01 ... ...

所有样本均用 ... ...剂染色 30 分钟，然后使用 Eazyreader 进行分析。 ... ...染色活细胞，因此 T-CMC 由死亡细胞的信号损失指示，而 ... ...亡细胞，导致受 T-CMC 攻击的细胞信号增加。两种信号可以同时检测到，因为两种荧光染料具有相似的激发光谱，但发射最大值不同。

应用 # 3 黑色侧壁 96 孔微量滴定板中的单细胞和细胞簇示例

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