携带密码子重编程神经氨酸酶基因的流感病毒作为减毒活疫苗的策略

Influenza Virus Carrying a Codon-Reprogrammed Neuraminidase Gene as a Strategy for Live Attenuated Vaccine

Dong J, Dong Z, Feng P, Gao Y, Li J, Wang Y, Han L, Li Z, Wang Q, Niu X, et al. Influenza Virus Carrying a Codon-Reprogrammed Neuraminidase Gene as a Strategy for Live Attenuated Vaccine. Vaccines. 2023; 11(2):391. https://doi.org/10.3390/vaccines11020391

Abstract

与灭活流感疫苗相比，减毒活流感疫苗可提供更广泛、更持久的保护。甲型流感病毒的神经氨酸酶 (NA) 表面糖蛋白对于受感染细胞中子代病毒颗粒的释放和传播至关重要。在这项研究中，我们从头合成了 NA 基因，其中 62% 的密码子根据哺乳动物密码子偏倚使用进行了同义改变。密码子重编程的 NA (repNA) 基因未能包装到病毒基因组中，而这可以通过在 3' 和 5' 末端部分恢复野生型 NA 序列核苷酸来实现。在一系列拯救的重组病毒中，我们选择了20/13repNA，其在repNA的3'和5'末端分别含有20和13个野生型NA核苷酸，并评估了其作为减毒流感活疫苗的潜力。50比野生型（WT）病毒高约10,000倍。小鼠鼻内接种 20/13repNA 病毒可诱导病毒特异性体液、细胞介导和粘膜免疫反应。接种 20/13repNA 病毒的小鼠可以免受同源和异源病毒的致命攻击。该策略可能为开发减毒流感活疫苗提供新方法，以更好、更快速地应对流感威胁。

一、简介

流感是一种高度传染性的急性呼吸道疾病，每年导致人类和家畜显着发病和死亡。该疾病是由流感病毒引起的，流感病毒是一种八节段、有包膜的RNA病毒[ 1 ]。疫苗接种被认为是预防流感最有效的方法。灭活疫苗和减毒活疫苗是当今可用的流感疫苗的两种主要类型[ 2 ]。当疫苗毒株与流行毒株之间存在紧密的抗原匹配时，灭活疫苗在降低健康人群临床疾病发生率方面显示出 70-90% 的功效 [ 3 , 4]。然而，灭活疫苗在产生粘膜免疫和细胞毒性 T 细胞反应方面受到限制，并且没有足够的交叉反应来防止抗原变体。相比之下，减毒流感病毒活疫苗不仅可以诱导体液抗体，还可以引发细胞介导的免疫反应，这可能提供针对抗原变异体的交叉保护[ 5,6,7 ]。

基于质粒的反向遗传学技术的进步使得设计具有导致减毒的独特特性的流感病毒基因组成为可能[ 8 , 9 ]。据报道，许多基因工程流感病毒，例如在基因组片段中进行删除修饰的流感病毒，可在动物模型中诱导免疫反应[ 10,11,12,13,14,15,16 ] 。然而，其中一些候选疫苗病毒无法复制，无法在含胚鸡蛋或 MDCK 细胞中繁殖，而这些细胞通常用于流感疫苗的生产系统。

在这项研究中，我们根据哺乳动物密码子的使用，通过在 NA 基因片段中引入片段规模的沉默突变，产生了含有密码子重编程 NA (repNA) 基因的具有复制能力的减毒重组流感病毒。将这些重组病毒在含胚卵和细胞中的生长潜力与亲本 PR8 病毒进行比较。此外，在小鼠模型中评估了repNA病毒的减毒表型、免疫反应以及保护功效。通过使用这种密码子重编程策略，我们的目标是探索一种开发生产方便、安全、有效的减毒流感活疫苗候选株的新方法。

4.10. 动物实验

六周大的雌性 BALB/c 小鼠，用异氟烷麻醉，通过鼻内 (in) 感染不同剂量的 20/13repNA 病毒和 wtPR8 病毒。接种后14天监测感染这些病毒的小鼠的体重和存活率。对照小鼠仅接种 50 µL PBS（模拟）。如果老鼠病情严重且体重减轻接近25%，就会被人道处死。50%致死剂量（LD 50）值通过Reed-Muench方法计算[ 29 ]。为了评估病毒复制滴度，每组小鼠（n= 3) 在接种后第3天和第5天处死。无菌取出肺并在 1 mL PBS 中均质化。如上所述，通过噬斑测定和MDCK细胞上的免疫染色来测定病毒滴度(ffu/mL)。

疫苗接种后 4 周，不同组的免疫小鼠经鼻内用 100 LD 50剂量的 wtPR8 病毒、10 LD 50小鼠适应的 H1N1 毒株（A/California/04/2009，CaO4）或 H3N2 毒株（A/Aichi/ 2/1986，X31），分别。攻击后三天，如上所述，在MDCK细胞中滴定已接种小鼠肺中wtPR8攻击病毒的复制。攻击后14天观察其余动物的体重和存活率。

4.11. 病毒特异性抗体的检测

初次免疫后四周，处死小鼠以获得血清、鼻洗液和气管肺洗液，如前所述[ 30 ]。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测鼻腔冲洗液和气管肺冲洗液中的血清 IgG 和 IgA 抗体。在 ELISA 测定中，96 孔聚苯乙烯微量滴定板用纯化的总 wtPR8 病毒蛋白在 4°C 下包被过夜。将病毒包被的平板与连续稀释的样品一起孵育后，用辣根过氧化物酶（HRP）、缀合的二级山羊抗小鼠 IgG 过氧化物酶或兔抗小鼠 IgA检测结合的抗体。

根据 WHO 推荐的方案（世界卫生组织，2002 年）进行血凝素抑制 (HI) 抗体检测。将小鼠血清用受体破坏酶在 37°C 下处理 16 小时，然后在 56°C 下热灭活 30 分钟。HI测定为HI滴度为能够完全抑制血凝的最高血清稀释度的倒数。检测限为滴度1:10。

4.12. 酶联免疫斑点测定

病毒接种后 10 天收集脾细胞，并分析流感病毒特异性 IFN-γ 分泌细胞的存在，如前所述 [ 31 ]。简而言之，96 孔 Multiscreen HA 硝酸纤维素板涂有 4 µg/mL 大鼠抗小鼠 IFN-γ 单克隆抗体在 50 µL PBS 中并在 4°C 下孵育过夜。将板洗涤并用（补充有 10% FCS、50 µM 2-β-巯基乙醇、青霉素 100 U/mL 和链霉素 100 µg/mL 的 RPMI 1640）在 37 °C 下封闭 2 小时。脾细胞 (10 6然后将来自免疫小鼠的细胞/孔添加到抗体包被的孔中。将细胞在完全 RPMI 培养基中与 2μg/mL NP147-155 肽（NP 肽；TYQRTRALV）一起在 37°C 下孵育 22 小时。经过大量洗涤后，通过与生物素化大鼠抗小鼠 IFN-γ 抗体、碱性磷酸酶缀合的链霉亲和素（BD PharMingen，圣地亚哥，加利福尼亚州）连续孵育来显露斑点。 ，美国）和 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四唑作为底物。使用ELISPOT读数器（BioReader 4000，Bio-Sys GmbH）对每个孔中的斑点进行计数，结果表示为一式三份小鼠脾脏样本的 IFN-γ 分泌细胞平均数±标准差（SD）。