具有淋巴结靶向和免疫佐剂双重功能的树状肽（KK2DP7）递送系统作为癌症免疫治疗的通用策略

A Dendrimer Peptide (KK2DP7) Delivery System with Dual Functions of Lymph Node Targeting and Immune Adjuvants as a General Strategy for Cancer Immunotherapy

Zhang, R., Tang, L., Wang, Y., Tian, Y., Wu, S., Zhou, B., Dong, C., Zhao, B., Yang, Y., Xie, D., Yang, L., A Dendrimer Peptide (KK2DP7) Delivery System with Dual Functions of Lymph Node Targeting and Immune Adjuvants as a General Strategy for Cancer Immunotherapy. Adv. Sci. 2023, 10, 2300116. https://doi.org/10.1002/advs.202300116

    由于免疫效果不足，个性化癌症疫苗的临床疗效仍需提高。创新佐剂和淋巴结靶向递送系统的开发是提高个体化疫苗临床疗效的关键。然而，目前仍缺乏一种制备简单、能够大规模生产、集佐剂和淋巴结靶向递送功能于一体的佐剂递送系统。在这里，这项工作报告了一种简单的树状聚合物多肽 (KK2DP7) 纳米颗粒增强了基于 OVA/新抗原的疫苗的免疫功效。由于其作为递送载体、免疫佐剂和树突状细胞迁移促进剂的多种功能，KK2DP7 有效提高抗原呈递细胞 (APC) 摄取和交叉呈递抗原的效率，并通过 APC 将抗原递送至淋巴结。引人注目的是，KK2DP7/OVA 的抗肿瘤效果优于常用的佐剂，如聚 (I:C)、CpG 和铝佐剂与 OVA 联合使用。此外，KK2DP7/OVA与抗PD-1抗体联合能够在术后复发肿瘤模型中预防肿瘤复发。因此，基于KK2DP7的癌症疫苗单独或与免疫检查点阻断疗法联合治疗肿瘤或术后肿瘤复发是增强抗肿瘤免疫的有力策略。此外，KK2DP7/OVA与抗PD-1抗体联合能够在术后复发肿瘤模型中预防肿瘤复发。因此，基于KK2DP7的癌症疫苗单独或与免疫检查点阻断疗法联合治疗肿瘤或术后肿瘤复发是增强抗肿瘤免疫的有力策略。此外，KK2DP7/OVA与抗PD-1抗体联合能够在术后复发肿瘤模型中预防肿瘤复发。因此，基于KK2DP7的癌症疫苗单独或与免疫检查点阻断疗法联合治疗肿瘤或术后肿瘤复发是增强抗肿瘤免疫的有力策略。

    肿瘤疫苗具有特异性高、毒性低、副作用少的特点。它们是替代或辅助传统疗法以提高疗效的良好选择。提高疫苗的体内免疫刺激效果是肿瘤免疫治疗领域的重要研究方向。适应性免疫反应主要在次级淋巴器官中启动，疫苗在淋巴结（LN）中的有效积累是癌症疫苗诱导强大的抗原特异性免疫反应的先决条件。[ 1 ]LN 是抗原呈递的主要部位，存在大量 APC。这些细胞与初始T细胞相邻，在摄取抗原后可以实现快速抗原呈递。因此，将肿瘤疫苗有效递送至淋巴结是提高疫苗功效的重要策略。目前，肿瘤疫苗向淋巴结的有效递送主要依赖于纳米递送系统。[ 2 ]由于纳米技术具有被APC捕获的固有特性，因此利用纳米技术进行癌症疫苗设计显示出巨大的前景。然而，目前的纳米疫苗系统在实现有效的肿瘤治疗方面仍然存在障碍。这可能部分是由于疫苗载体的设计不尽如人意，主要是由于其功能单一。大多数载体不具备免疫佐剂的功效，其合成过程复杂，不利于后续大规模使用。[ 2 ]一些研究报道，一些新的递送系统既可以用作递送系统又可以用作佐剂，并且还可以靶向淋巴结。但合成工艺仍较为复杂，不利于转化研究过程中的质量控制和规模化制备。[ 3 ]因此，迫切需要开发一种制备简单、集免疫佐剂和淋巴结特异性靶向递送功能于一体的新型多功能递送系统。

    在此，我们设计了一种简单的树枝状聚合物纳米颗粒系统（KK2DP7）作为新型癌症治疗纳米疫苗，以增强基于 OVA 的疫苗的免疫功效。DP7（VQWRIRVAVIRK）是一种新型阳离子亲水性抗菌肽，是根据我们前期研究的氨基酸活性预测方法开发的。然后我们用胆固醇修饰 DP7，发现 DP7-C 具有作为递送载体和免疫佐剂的双重功能。[ 4 ]尽管之前的实验已经证明DP7-C可用于增强抗原负载DC疫苗的抗肿瘤效果，但由于树突状细胞（DC）疫苗的体外制备复杂且耗时，我们认为直接孵育DP7 -C 与抗原一起给药将使患者更快地从疫苗中受益。遗憾的是，DP7-C与抗原复合后并没有明显的LN靶向作用。因此，在本实验中，我们设计了具有增强LN靶向性的树枝状大分子KK2DP7聚合物纳米疫苗系统。作为一种递送载体，它可以通过小窝蛋白和网格蛋白依赖性途径有效地将 OVA 递送至 BMDC。作为免疫佐剂，它可以通过激活TLR2-NF- κ来刺激BMDC成熟B信号通路。此外，KK2DP7/OVA进入LN是通过DC的运输实现的（方案 1）。在动物实验中，KK2DP7/OVA的抗肿瘤效果优于常用佐剂如聚(I:C)、CpG、铝佐剂与OVA联合的抗肿瘤效果。此外，KK2DP7/OVA联合抗PD-1抗体在术后复发肿瘤模型中表现出优异的抗肿瘤效果，能够预防肿瘤复发，KK2DP7/neoantigen联合抗PD-1抗体在术后复发肿瘤模型中也表现出优异的抗肿瘤效果。 LL2肿瘤模型。因此，单独使用基于 KK2DP7 的癌症疫苗或与免疫检查点阻断 (ICB) 疗法联合治疗肿瘤是增强抗肿瘤免疫的强大通用策略。

T 细胞增殖检测

    为了验证 KK2DP7/OVA 疫苗对 T 细胞增殖的影响，在免疫后第 7 天，使用淋巴细胞分离了用 KK2DP7 (60 µg)/OVA (20 µg) 免疫 3 次（每周一次）的小鼠的脾细胞。分离液并根据制造商的方案用 CFSE 试剂盒染色。CFSE染色的脾细胞用OVA刺激3天，然后用抗小鼠CD3 (145-2C11)和抗小鼠CD8 (53-6.7)荧光抗体(BD)染色。然后，通过流式细胞术测量细胞增殖。

CD8四聚体检测

    免疫后第 7 天，分离用 KK2DP7 (60 µg)/OVA (20 µg) 免疫 3 次（每周一次）的小鼠的脾细胞，并用藻红蛋白标记的 SIINFEKL-MHC I 四聚体染色。按照标准方案，使用四聚体染色测定分析抗 CD8-APC (53-6.7) 和抗 CD3-FITC (145-2C11)，以确定 OVA 特异性 CD8 + T 细胞的百分比。

酶联免疫斑点测定

对于 ELISPOT 测定，将来自用 KK2DP7 (60 µg)/OVA (20 µg) 免疫 3 次（每周一次）的小鼠的脾细胞在免疫后第 7 天分离进行实验。ELISPOT 测定是根据制造商的说明进行的。简言之，将2×10 5小鼠脾淋巴细胞接种到预涂有抗IFN- γ抗体的96孔微量滴定板中。接下来，添加10μgmL -1 OVA，并将板在37℃下孵育。48小时后，从孔中吸出培养基，并预冷ddH 2在 4°C 下添加 O 10 分钟以裂解细胞。然后用洗涤缓冲液洗涤板五次。接下来，将稀释的生物素化二抗添加到每个孔中，然后在37℃下孵育1小时。对于酶联亲和素孵育，将稀释的亲和素酶工作溶液添加到每个孔中并在37℃下孵育1小时。然后加入配制好的氨乙基咔唑溶液，在37℃避光条件下显色反应约15分钟。最后，对板进行拍照并使用 BioReader 4000（Byosys，Karben，德国）进行读取。

基于 OVA 的纳米疫苗预防肿瘤复发模型

在本研究中，雌性 C57BL/6 小鼠被随机分为四组：1）手术（n = 6），2）手术+抗 PD-1 抗体（n = 6），3）手术+KK2DP7/OVA（n = 6)，和4) 手术+KK2DP7/OVA+抗PD-1抗体( n = 6)。第10天，在小鼠右背部皮下注射1×10 6 EG7-OVA细胞。10天后，皮下肿瘤体积约150 mm 3被切除。第 4 天和第 11 天，第 3 组和第 4 组的小鼠通过皮下注射接种 KK2DP7 (60 µg)/OVA (20 µg)。第2组和第4组的小鼠在第5、8、12和15天腹腔注射抗PD-1抗体（每只小鼠每次注射200μg）。每2天记录小鼠的肿瘤体积和体重。肿瘤体积 = 4/3 × π × 长度/2 × 宽度/2 × 宽度/2。当肿瘤体积达到1500mm 3时对小鼠实施安乐死。第40天，存活的小鼠皮下注射1×10 6EG7-OVA 和 CT26 细胞评估免疫记忆。对于 EG7-OVA 细胞攻击（KK2DP7/OVA+抗 PD-1）后存活至 60 天的无肿瘤小鼠，从存活小鼠中收获脾细胞并用抗 CD3（145-2C11）、抗-CD8 (53-6.7)、抗 CD62L (MEL-14) 和抗 CD44 (IM7)。使用FlowJo软件进行数据分析。