什么是明场双因子酶联免疫斑点分析？

简单来说，它是一种在单细胞水平上，同时检测同一群细胞中能够分泌两种不同特定因子（如细胞因子）的免疫细胞的技术。

让我们来拆解这个术语：

酶联免疫斑点分析： 即 ELISpot。这是一种高灵敏度的技术，通过在细胞培养板底部包被捕获抗体，来“捕捉”细胞分泌的蛋白质，并在其分泌位置形成“斑点”。

每个斑点代表一个能够分泌该靶蛋白的活性细胞。

双因子： 指的是在一次实验中对两种不同的目标因子（例如，干扰素-γ 和白细胞介素-2）进行同步检测。

明场： 指的是最终的检测结果可以通过普通的光学显微镜在明场下观察和计数，而不需要荧光显微镜。这是通过酶促显色反应产生不溶性的有色沉淀来实现的。

与传统（单因子）ELISpot 和 荧光双因子ELISpot 的区别

技术原理与步骤

明场双因子ELISpot的成功关键在于使用两种互不干扰、能产生鲜明对比颜色的酶促显色系统。

典型步骤：

1、包被： 在PVDF或硝酸纤维素膜微孔板的同一个孔中，预先包被两种不同的捕获抗体，分别针对要检测的因子A和因子B。

2、加入细胞与刺激： 将待测的淋巴细胞（如PBMCs）和特异性抗原（或多克隆刺激剂）加入到孔中，并进行培养（通常为24-48小时）。在培养期间，

被激活的细胞会分泌因子A和/或因子B。

3、细胞因子捕获： 细胞分泌的因子会立即被孔板底部紧邻的捕获抗体所捕获。

4、洗细胞： 培养结束后，洗去细胞，留下固定在板上的因子-捕获抗体复合物。

5、加入检测抗体： 依次加入两种生物素化的检测抗体，分别识别因子A和因子B的不同表位。

6、加入酶联物：

    首先加入一种酶联物，例如辣根过氧化物酶 标记的链霉亲和素。它与生物素结合。

    然后加入HRP的底物（如AEC），产生红色不溶性沉淀，形成红色斑点。这些斑点代表分泌因子A的细胞。

    关键步骤： 通过加热或化学方法灭活HRP的活性，确保下一步的显色反应不会相互干扰。

7、加入第二种酶联物：

    加入另一种酶联物，例如碱性磷酸酶 标记的链霉亲和素。

    加入AP的底物（如BCIP/NBT），产生蓝色/黑色不溶性沉淀，形成蓝色斑点。这些斑点代表分泌因子B的细胞。

8、终止与读数： 用去离子水冲洗终止反应，待板干燥后，在Bioreader 7000E自动ELISpot读数仪下进行分析。

结果解读

使用Bioreader 7000E您会看到三种类型的斑点：

红色斑点： 只分泌因子A的细胞。

蓝色/黑色斑点： 只分泌因子B的细胞。

双色叠加斑点（可能呈现紫色或中心重叠）： 同时分泌因子A和因子B的细胞。这是该技术最核心的价值所在，它能够识别出功能最强的“多功能”T细胞。

通过计数不同类型的斑点，研究人员可以获得丰富的信息：

抗原特异性T细胞的总频率（红色+蓝色+双色）。

每种细胞因子的分泌细胞频率。

多功能T细胞（同时分泌两种因子）的频率，这通常与更有效的免疫保护相关。

应用领域

疫苗研发与评估： 评估疫苗诱导的细胞免疫反应的强度和广度，特别是多功能T细胞的比例。

传染病研究： 研究对病毒（如HIV、HCV、新冠病毒）、细菌和寄生虫的免疫应答。

肿瘤免疫学： 评估肿瘤抗原特异性T细胞反应，监测过继性细胞治疗（如CAR-T）的疗效。

自身免疫病与过敏研究： 分析自身反应性T细胞或过敏原特异性T细胞的细胞因子谱。

基础免疫学研究： 研究T细胞的分化、功能和记忆。

优势：

高通量 & 高信息量： 一次实验提供两种因子的数据，并揭示细胞的多元分泌功能。

单细胞分辨率 & 高灵敏度： 能够检测到频率极低的抗原特异性细胞。

设备普及： 无需昂贵的荧光设备，普通实验室即可开展。

结果直观： 彩色斑点易于观察和验证。